DASAR
– DASAR EKSTRAKSI DNA DAN JARINGAN.
LAPORAN PRAKTIKUM
Oleh :
Amir Umalekhay
05171311002
PROGRAM STUDI BUDIDAYA PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
UNIVERSITAS KHARUN
TERNATE
2016
KATA
PENGANTAR
Puji
syukur penulis panjatkan kehadirat Allah swt yang telah memberikan nikmat yakni
nikmat kekuatan, kesehatan dan kesempatan sehingga penulis dapat menyelesaikan
Laporan Praktikum ini dengan Judul :
Dasar – dasar Ekstraksi DNA dan Jaringan.
Tak lupa pula
salawat serta salam penulis haturkan kepada junjungan Nabi besar Muhammad saw,
karena berkat perjuangan beliau dan para sahabatnya yang rela mengorbankan jiwa
dan raga mereka, sehingga kita yang jauh dari pelosok duniapun dapat merasakan
kenikmatan dari pada islam itu sendiri.
Kita selaku umat
manusia tak pernah luput dari kesalahan dan kehilafan sehingga apabila terdapat
kesalahan dan kekeliruan didalam setiap penulisan kata, maupun kalimat maka
penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun untuk kesempurnaan Laporan
ini.
Ternate, 28
Desember 2016
Penulis,
DAFTAR ISI
KATA
PENGANTAR .................................................................... i
DAFTAR ISI ................................................................................... ii
I. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang ....................................................................... 1
1.2. Tujuan .................................................................................... 2
1.3. Manfaat .................................................................................. 2
II. TINJAUAN
PUSTAKA
2.1.
Analisis DNA ........................................................................ 3
2.2.
Amplifikasi PCR .................................................................... 3
2.3.
Elektroforesis ......................................................................... 4
III.
METODOLOGI PRAKTIKUM
3.1. Waktu
dan Tempat ................................................................ 5
3.2. Alat
dan Bahan ...................................................................... 5
3.3.
Prosedur Kerja ....................................................................... 7
IV. HASIL
DAN PEMBAHASAN
4.1. Aplikasi
metode ekstraksi DNA ............................................ 9
4.2. DNA Hasil Ekstraksi ............................................................. 11
V. PENUTUP
5.1. Kesimpulan
............................................................................ 12
5.2. Saran ...................................................................................... 12
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
I.
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Deoxyribose Nucleic Acid adalah molekul utama
yang metode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam
setiap organisme. DNA tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa,
basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. Molekul DNA ini
terikat membentuk kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan kloroplas
(Agus dan Sjafaraenan, 2014).
Deoxyribose Nucleic Acid yang
menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang terususn helix Ganda
(double helix), yang basa nitrogen dan kedua “benang” polinukleotida saling
berpasangan dalam pasangan yang tetap melali ikatan hidrogen dan antara
nukleotida yang satu dengan yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. DNA
terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup dan disebut sebagai “cetak biru
kehidupan” karena molekul ini berperan penting sebagai pembawa informasi
hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme lain (Agus
dan Sjafaraenan, 2014).
Deoxyribose Nucleic Acid (DNA) dapat
mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu, DNA juga bisa diisolasi.
Isolasi DNA adalah suatu teknik dimana hasil akhirnya strand-strand DNA dapat
terpisah dalam bentuk kumpulan strand berwujud benang-benang putih. Tujuan
isolasi DNA adalah mendapatkan ekstrak DNA pada jaringan atau sel yang
diinginkan (Agus dan Sjafaraenan, 2014).
Isolasi DNA ini sangat penting dalam bidang bioteknologi maupun bidang
biologi molekuler. Pengenalan isolasi DNA sangat penting mengingat bioteknologi
pada akhir-akhir ini sangat maju. Terlebih untuk bidang biologi molekuler.
Beberapa bakteri telah berhasil diintroduksi ke dalam tanaman seperti padi
kapas dan kedelai. Pentingnya bioteknologi untuk perkembangan keanekaragaman
hayati di masa mendatang memerlukan keterampilan dan pemikiran. Salah satunya
adalah dengan mengetahui cara pengumpulan DNA dan prinsip dasarnya sebagai
pijakan untuk mempelajari biologi molekuler pada khususnya (Agus, dan
Sjafaraenan, 2014).
1.2. Tujuan
Adapun
tujuan dari praktikum ini adalah sebagai berikut:
1. Agar mahasiswa dapat mengetahui langkah-langkah
dalam ekstraksi DNA.
2. Mengetahui alat dan bahan yang
digunakan dalam proses ekstraksi DNA jaringan.
1.3. Manfaat
Manfaat dari praktikum ini adalah menambah ilmu pengetahuan
kepada mahasiswa, tentang cara melakukan ekstraksi DNA jaringan dengan baik,
dan mengetahui alat dan bahan.
11. TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Analisis DNA
Deoksiribo Nucleat Acid (DNA) adalah asam
nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur
perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan
komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan
pasangan basa. Sebuah sel
memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh
sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap dari materi genetik (DNA) yang
dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA juga dapat
diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan (Suryo,
2010).
Gambar 1.Struktur DNA (Suryo, 2010)
2.2. Amplifikasi PCR
Ampifikasi PCR adalah perbanyakan DNA menggunakan PCR
dengan ketentuan kondisi suhu reaksi amplifikasi
PCR untuk gen hormone pertumbuhan adalah sebagai berikut: satu tahap reaksi
denaturasi awal pada suhu 94˚C. Selama 5
menit, diikuti dengan 30 siklus amplifikasi yang masing-masing terdiri dari:
(i) denaturation pada suhu 94˚C. selama 45 detik, (ii) annealing pada suhu 60˚C. selama 45
detik, dan (iii) extension pada suhu 72˚C. selama 1
menit; diikuti dengan satu tahap polimerasi final pada suhu 72˚C. Selama 5
menit, (purwoko 2002).
Hasil dari amplifikasi
dengan menggunakan reaksi PCR langsung digunakan dalam dengan menggunakan
enzim. Amplifikasi dipakai sesuai kebuthan dan tujuan diadakanya ekstraksi
jaringan DNA ataupun ampifikasi. Tahap
pembacaan DNA adalah dengan cara
ampifikasi. Teknik ini digunakan untuk pembacaan setelah diadakan isolasi.
Biasanya amplifikasi menggunakan metode PCR, (Putranto, 2006)
Waktu yang
diperlukan untuk proses ini sekitar 30 detik pada suhu 95˚C. atau
15 detik pada suhu 97˚C. Apabila DNA target mengandung banyak nukleotida G/C, suhu
denaturasi dapat ditingkatkan. Denaturasi yang tidak lengkap akan menyebabkan
renaturasi secara cepat, sedangkan waktu denaturasi yang terlalu lama dapat
mempengaruhi enzim taq polymerase. Hal ini sangat berpengaruh terhadap
keberhasilan proses PCR (Giri 2004).
2.3. Elektroforesis
Elektroforesis adalah
teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik , Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan
dipisahkan..Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan
listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul
yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus
listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya
maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif.
Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap
massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya (purwoko
2002).
III. METODOLOGI PRAKTIKUM
3.1. Waktu dan Tempat
Praktikum Bioteknologi ini
dilaksanakan pada hari Sabtu tanggal 14
November 2016, pukul 14.00 – 05.00 WIT bertempat di Laboratorium Biotek (Gedung
LPPM) Ternate Selatan, Universitas Khairun Ternate.
3.2. Alat
dan Bahan
Alat yang digunakan dalam praktikum
ini dapat dilihat pada table berikut ini.
Tabel 1. Alat yang digunakan dalam praktikum
Alat
|
Fungsi
|
Bahan
|
|
Mortar
dan Pestle
|
Menggerus
dan menghaluskan sampel
|
Ikan
|
|
Centrifuge
|
Memisahkan
dan mengendapkan padatan dari larutan
|
alkohol
|
|
Mikro pipet
|
Memindahkan cairan dengan volume yang sangat kecil
|
Air
|
|
Termometer
|
Untuk mengukur suhu
|
ethanol
|
|
Masker
|
Untuk mencegah debuh atu zat kimia atau larutan lainnya
|
Buffer Aw 2
|
|
Timbangan Analitik
|
Untuk
mengukur jumlah zat yang di perlukan
|
Buffer ATl
|
|
Vortekx
|
Untuk menghomogenkan cairan
|
||
Beker glas
|
Menghitung
larutan kimia yang tinggi dalam jumlah tertentu.
|
||
Microwave
|
Untuk
memanaskan atau mengeringkan bahan bahan yang di pakai
|
3.4.
Prosedur kerja eksraksi DNA
1. Tempatkan 25 mg sampel pada mortar/tabung
yang sesuai dengan ukuran sampel, kemudian dengan menambahkan 300 µl buffer
ATL, lalu digerus.
2. Pipet 180 µl bagian supernatan dan
dimasukkan ke dalam tabung 2 ml. Selanjutnya melakukan proses purifikasi dengan
menggunakan DNeasy Blood and Tissue Mini
Kit secara manual.
3. Panaskan heating block 56oC,
sambil menunggu kenaikan suhu. Pada 180 µl sampel yang sudah hancur,
ditambahkan 20 µl proteinase K, vortex, kemudian di inkubasi pada suhu 56oC
selama 1-3 jam. (Vortex sekali-kali selama masa inkubasi)
4. Setelah diinkubasi, kembali di vortex
kemudian sentrifugasi selama beberapa detik lagi.
5. Tambahkan 200 µl Buffer AL, vortex kemudian
sentrifugasi selama beberapa detik, selanjutnya tambahkan 200 µl ethanol (96 –
100%), dan dicampurkan dengan cara vortex atau pipeting agar menghasilkan
larutan yang homogen.
6.
Pipet larutan dari tube setelah penambahan 200 µl Buffer AL dan memasukkannya ke dalam DNeasy Mini Spin Column yang ditempatkan dalam 2 ml collection
tube.
7. Sentrifugasi pada 6000xg (8000 rpm) selama 1
menit. Buang collection tube yang berisi supernatan.
8. Tempatkan DNeasy
Mini Spin Column pada 2 ml collection tube yang baru.
9. Tambahkan 500 µl Buffer AW1, sentrifugasi
selama 1 menit pada 6000xg (8000 rpm). Buang collection tubenya dan tempatkan DNeasy Mini Spin Column pada 2 ml
collection tube yan baru.
10. Tambahkan 500 µl Buffer AW2, sentrifugasi
selama 3 menit pada 20000xg (14000 rpm)
untuk mengeringkan membrane DNeasy. Buang collection tube.
11.
Tempatkan DNeasy Mini Spin Column
pada 2 ml collection tube yang baru, sentrifugasi selama 1 menit pada 20000xg
(14000 rpm) untuk mengeringkan DNeasy membrane dari ethanol. Buang collection
tube dan tempatkan DNeasy Mini Spin
Column ke dalam tabung 1.5 ml atau 2 ml.
12. Pipet 100-200 µl Buffer AE dan masukkan ke
dalam DNeasy membrane.
13. Inkubasi pada suhu ruang selama 1 menit.
14. Sentrifugasi selama 1 menit pada 6000xg (8000
rpm) untuk proses elusi.
15.
DNA hasil elusi dapat langsung digunakan untuk proses PCR atau simpan pada suhu
-20oC atau -80oC untuk penyimpanan lama.
IV. HASIL
DAN PEMBAHASAN
4.1 Aplikasi
metode ekstraksi DNA
Peralatan
yang dapat digunakan dalam praktikum memiliki fungsi dan cara menggunakannya
masing – masing seperti centrifuge, beker glas, termometer, masker, vortex,
neraca atau timbangan analitik, mortar dan pastle, microwave, dan mikropipet
seperti dibawah ini:
1. Sentrifuge
berfungsi untuk memisahkan dan mengendapkan kepadatan dari larutan. Cara
mengaplikasikannya, membuka penutup sentrifuge terlebih dahulu untuk memasukkan
sampel. Kemudian tutup kembali selama
sampel berputar harus tertutup rapat,
untuk membuka tunggu sampai alat sentrifuge berhenti berputar sendiri,
penempatan sampel harus dalam keadaan
seimbang selanjutnya mengatur waktu pada
saat sampel di putar.
2. Beker
glas, berfungsi untuk menanmpung air dan bahan kimia dalam jumlah yang banyak.
Cara mengaplikasikannya gelas ukur letakkan beker gelas di atas meja kemudian masukkan
air untuk di panaskan dalam microwave.
3. Termometer
berfungsi untuk mengukur suhu (temperatur). Cara mengaplikasikannya di letakkan
air untuk menentukan perubahan suhu
tinggi atau rendah.
4.
Masker
berfungsi sebagai melindungi terjadinya debuh atau zat lainnya masuk
kedalam organ pernapasan.Cara mengaplikasikannya diletakkan bagian hidung dan
mulut untuk mencegah debuh atau zat
kimia lainya mengganggu saluran
pernapasan.
5. Vortex
berfungsi untuk menghomogenkan cairan. Cara mengaplikasikannya tube diletakkan
pada meja,kemudiaan tmenekan permukaan tube menggunakan tangan saat vortex.
6. Neraca
atau timbangan analitik berfungsi untuk menimbang sampel dalam jumlah yang
banyak jika di butuhkan. Cara mengaplikasikannya, menekan tombol power untuk
menghidupkan timbangan analitik terlebih dahulu, dan selanjutnya menyetel angka
sampai pada angka 0, terus masukkan
sampel dalam timbangan berapa grm dari
hasil timbangan yang di butuhkan. Sampel yang sudah di timbang dan di keluarkan
dari timbangan.
7. Mortar
dan Pestle, berfungsi untuk menggerus dan menghaluskan sampel yang masih keras.
Cara mengaplikasikannya letakan
di atas meja kemudian masukkan sampel atau daging ikan pada mortar kemudian di
gerus hingga halus menggunakan peshe.
Sampel sudah di haluskan kemudian di pindahkan pada tube untuk melakukan
ekstraksi jaringan DNA.
8. Microwave,
fungsi dari microwave untuk memanaskan air ataupun larutan lainnya juga mengeringkan larutan. Cara mengaplikasikannya, menekan
tombol power untuk menghidupkan
microwave, dan selanjutnya
msukkan air untuk di panaskan setelah di masukkan tutup kembali
microwave tersebut. Kemudian menentukan suhu yang di panaskan air
tersebut.
9. Micro
Pipet berfungsi untuk memisahkan cairan
dalam volume yang sedikit
Cara mengaplikasikannya:
a.
Set
atau volume cairan yang di butuhkan,
b.
Tekan tip,
c.
Tekan"Plungger button" atau penyedot sampai
batas pertama
d.
Masukan
tip dalam sampel
e.
Ambil
atau sedot sampel : Harus posisi tegak lurus.
f.
Lepaskan
tip
4.2.
DNA Hasil Ekstraksi
Dari hasil ekstraksi DNA jaringan yang dilakukan selama
praktikum, tidak memuaskan karena tidak dapat diselesaikan pada tahapan PCR dan elektroforesis karena
keterbatasan waktu. Jadi hasil dari ekstraksi DNA jaringan kurang memuaskan.
Untuk mendapatkan hasil ekstraksi DNA sesuai dengan tahapan
praktikum, pada tahapan PCR dan elektroforesis dilakukan maka hasil tersebut
terlihat sangat jelas dan memuaskan.
V. PENUTUP
5.1. Kesimpulan
Penulis menyimpulkan bahwa tahapan dari
ekstraksi DNA jaringan sebagai berikut:
1.
Langkah-langkah dalam Ekstraksi DNA
adalah pengambilan sampel, ditimbang dan digerus sampai halus, dimasukkan
kedalam tube, dicampurkan dengan alkhol, divortex, dicentrifuge, pencampuran
dengan buffer, difortex, dicentrifuge dan dicampurkan dengan Etanol.
2.
Alat dan bahan yang digunakan dalam
proses ekstraksi DNA adalah Mortal dan pestle, Centrifuge, Mikropipet,
Termometer, Timbangan Analitik, Vortex, Beker glas, dan Mikrowafe. Ikan,
Alkhol, Air, Ethanol dan Buffer ATL.
5.2. Saran
Saran yang dapat
penulis sampaikan di antaranya adalah sebagai berikut:
1.
Dalam pelaksanaan praktikum, sebaiknya dilakukan dengan
hati-hati dan teliti supaya mendapatkan hasil yang lebih akurat.
2.
Selama praktikum,
sebaiknya menggunakan jas laboratorium
3. Peralatan yang digunakan jangan sampai terkontaminasi
terhadap benda apapun.
4.
Hindari
sentuhan oleh tangan, karena kemungkinan sel kulit pada tangan kita akan
mempengaruhi perubahan DNA yang sedang
kita amati.
DAFTAR
PUSTAKA
Agus, Rosana dan Sjafaranain. 2014. Penuntun Praktikum Genetika.
Makassar.Dwidjoseputro. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan.
Jakarta.
Giri-Rahman EA . 2004. Regulasi Ekspresi Gen Pada Organisme Bakteri.
Bandung : KPP Bioteknologi Bandung.
Kimball, J. John. 1992. Biologi. Erlangga. Jakarta.madura cattle. Surakarta: b i o d i v e r s i t a
s volume 4, nomor 1.
Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha
Muda dan USESE Foundation. Bogor.oryzae dan Absidia corymbifera. Bogor : Menara
Perkebunan, 2006, 74(1).
Purwoko,
Agus. 2003. Polimorfisme dna pada lokus-2 gen hormon pertumbuhan.
Putranto,
Riza a. 2006. Karakterisasi gen
penyandi lipase dari Kapang rhizopus sapi madura “dna polymorphism at
locus-2 of growth hormone gene of Suharsono dan Widyastuti, Utut.
2006. Pelatihan Singkat Teknik Dasar Pengklonan Gen. IPB Press.
Bogor.
Suryo, 2010. Genetika Manusia.
Gajah Mada University Press. Yogyakarta.
Lampiran Gambar
Pengambilan
daging ikan sebagai sampel Penimbangan
daging ikan
Memasukkan cairan ethanol pada tube Melakukan centifurage
DNA
Vortex Memaskan air pada microwave
Memindahkan
hasil DNA Hasil
DNA yang jernih
Mengukur suhu air yang di panaskan Mengsterilkan sampel
